Бабанин А.А., Беловицкий О.В., Скребкова О.Ю. ПОВРЕЖДЕНИЕ КОМПОНЕНТОВ АЭРОГЕМАТИЧЕСКОГО БАРЬЕРА В УСЛОВИЯХ ОСТРОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ

Симферополь (Украина)

В настоящее время считается установленным отрицательное воздействие этанола на дыхательный центр, эпителий бронхов, структурные элементы стенок альвеол, легочный сурфактант, а также на активность a-1-антитрипсина, проницаемость сосудистых стенок и микроциркуляцию в малом круге кровообращения, фагоцитарную активность и другие свойства лейкоцитов и альвеолярных макрофагов, показатели естественного иммунитета.

АГБ представляет собой структуру не только обеспечивающую газообмен, но и участвующую во многих неспецифических реакциях организма. Система сурфактанта легких, являясь частью АГБ, характеризуется сложными и интенсивными морфо-функциональными взаимоотношениями как внутри себя, так и со всеми компонентами АГБ, значение которых для макроорганизма еще окончательно не определено [2, 7, 8].

Основная функция сурфактанта легких заключается в стабилизации просвета альвеол. Кроме этого, сурфактант легких участвует в осуществлении местной защиты легкого, в газообмене и поддержании водного баланса в легких [8, 9, 10]. Белковый состав сурфактанта легких представлен апопротеинами, которые, как предполагается, вырабатываются главным образом альвеолоцитами II типа и служат для фиксации фосфолипидов на границе раздела жидкость- воздух. Существует несколько типов белков сурфактанта - SP-A, SP-B, SP-C и SP-D [2]. Поскольку, помимо поддержания стабильности альвеолы, сурфактант легких имеет еще ряд многообразных функций, его повреждение существенным образом сказывается на развитии негативных изменений в легких под воздействием этанола.

Важным патогенетическим звеном развития повреждения легких в условиях острой алкогольной интоксикации является нарушение системы сурфактанта и возникновение ателектазов.

В этой связи, целью настоящего исследования явилось: выявление и изучение реакции сурфактант-ассоциированных белков на воздействие этанола в условиях острой алкогольной интоксикации (ОАИ).

В качестве материала использовали легкие 48 беспородных половозрелых белых крыс массой 180-200 г. ОАИ моделировали на 40 крысах по общепринятой методике для токсикологическго эксперимента [4]. Выбор вида животных для эксперимента мотивирован данными литературы, подтверждающими, что отравление крыс этанолом адекватно моделирует морфогенез патологии человека. Животные были распределены по срокам наблюдения: 15 минут, 30 минут, 1 час, 3 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа и 3 суток после однократного введения этилового спирта, что позволило хронологически проследить динамику морфологических изменений в легких в условиях ОАИ и учитывать особенности метаболизма этанола в организме в фазах резорбции и элиминации. Контрольную группу составили 8 крыс. Животных выводили из опыта декапитацией гильотинным ножом. Объектом исследования служили удаленные легкие крыс

[5].

Иммуногистохимическое исследование проводили по методике Nogee L.M. et al. с использованием кроличьих поликлональных антител к сурфактант- ассоциированным белкам SP-A, SP-B и SP-C.

Данные, полученные нами в результате экспериментальных исследований, позволили в обобщенном виде представить патогенез изменений компонентов АГБ при остром воздействии этанола.

Результаты, полученные при иммуногистохимическом исследовании сурфактант-ассоциированных белков SP-A, SP-B и SP-C, свидетельствовали о том, что в контрольной группе животных присутствие указанных белков во всех случаях отмечалось в альвеолоцитах II типа.

В некоторых случаях присутствие указанных белков отмечалось в виде мелких глобулярных скоплений под такой мономолекулярной пленкой, что, по- видимому, свидетельствует о присутствии сурфактант-ассоциированных белков в местах формирования тубулярного миелина, локализующегося в гипофазе сурфактанта и являющегося предшественником и/или одной из форм внеклеточного эндогенного сурфактанта на внутриальвеолярной поверхности.

Во всех наблюдениях у животных контрольной группы присутствие указанных белков отмечалось в цитоплазме немногочисленных альвеолярных макрофагов, располагающихся либо в альвеолярных «нишах», либо свободно в просвете альвеол. При этом гранулы сурфактант-ассоциированных белков обнаруживались практически во всех макрофагальных элементах. Следует отметить, что чаще всего в цитоплазме альвеолярных макрофагов присутствовали SP-B и SP-C, тогда как наличие SP-A в этих клетках нам установить не удалось. Последний белок чаще обнаруживался в просвете респираторных бронхиол, а также в цитоплазме нереснитчатых бронхиолярных клеток (клетки Клара), что свидетельствует, с одной стороны, о том, что этот белок помимо альвеолоцитов II типа синтезируется этими бронхиолярными клетками, а с другой - о том, что SPA удаляется из просвета альвеол не столько за счет его фагоцитоза альвеолярными макрофагами, сколько за счет его «дрейфа» в респираторные бронхиолы.

Анализ полученных данных подопытной серии животных указывает на то, что через 15 мин и 30 мин после начала эксперимента в локализации и распределении сурфактант-ассоциированных белков были незначительные изменения. Появляются полнокровие сосудов, признаки интерстициального отека. Следует отметить, что в этот период в просвете альвеол определялись единичные белоксодержащие гранулы или, реже, их скопления.

Через 1-3 часа после введения этилового спирта в локализации сурфактант-ассоциированных белков происходят существенные изменения. Нарастали явления интерстициального отека. Непрерывность протеинсодержащего поверхностного внутриальвеолярного слоя местами нарушалась. В просвете альвеол определялись отдельные белоксодержащие гранулы или их скопления, не связанные с альвеолярной поверхностью. Анализ показал, что эти скопления представлены в основном SP-C. Содержание сурфактант-ассоциированных белков в альвеолоцитах практически не изменялось. Количество альвеолярных макрофагов значительно увеличилось, в цитоплазме большинства из них отмечалось наличие сурфактант- ассоциированных белков.

Через 3-6 часов после введения этанола по мере нарастания явлений интерстициального и интраальвеолярного отека, почти повсеместно нарушалась непрерывность протеинсодержащего поверхностного внутриальвеолярного слоя. В большинстве альвеол этот слой обнаруживался в виде отдельных красных или красновато-розовых полосок различной протяженности, расположенных на поверхности альвеолярных клеток. Местами в просвете альвеол определялись отдельные белоксодержащие гранулы или их скопления, свободно «плавающие» в отечной жидкости. Причем, по мере увеличения продолжительности эксперимента, число таких внутриальвеолярных белковых скоплений увеличивалось.

Это указывает на то, что в эти сроки эксперимента альвеолоциты II типа сохраняют способность к синтезу и секреции сурфактанта легких в просвет альвеол, а постепенное накопление отечной жидкости приводит к частичному отслоению поверхностно-активного вещества с внутриальвеолярной поверхности. Следует также отметить, что в указанные сроки в просвете альвеол увеличивалось количество свободно располагающихся альвеолярных макрофагов, в цитоплазме большинства из которых отмечалось наличие относительно большого количества сурфактант-ассоциированных белков. Это может говорить в пользу того, что в условиях раннего интраальвеолярного отека усиливаются процессы катаболизма сурфактанта легких, поскольку альвеолярные макрофаги активно фагоцитируют сурфактантные белки, что может быть связано с нарушением качественного состава сурфактанта легких под воздействием проникающих в просвет альвеол плазменных белков или непосредственно выделяемого через структуры АГБ этанола. Увеличивалось содержание сурфактант-ассоциированных белков в просвете респираторных бронхиол. При этом в этой части респираторного отдела легких обнаруживались все три исследуемых нами белка.

В сроки 6-12 часов от начала эксперимента в большинстве альвеолоцитов II типа отмечались явления запустевания зон, в которых в норме обнаруживались указанные белки. Лишь единичные альвеолоциты II типа содержали гранулы SP- B, тогда как следы SP-A и SP-C в подавляющем большинстве клеток не определялись. Это свидетельствует, с одной стороны, о резком снижении белоксинтезирующей функции этих клеток в отношении SP-A и SP-C, а с другой - о сохраняющейся даже в условиях нарастающих дистрофических и деструктивных изменений альвеолоцитов II типа функции синтеза и секреции SP- B.

В этот период сурфактант-ассоциированных белки, как правило, обнаруживались не на внутриальвеолярной поверхности, а внутри альвеол в виде скоплений, свободно располагающихся в большом количестве отечной жидкости. Такие белковые конгломераты нередко заполняли большую часть альвеолярного пространства и были представлены, в основном, SP-B, а два других сурфактант- ассоциированных белка определялись лишь в следовых количествах. При этом нередко такие альвеолы с явлениями выраженного интраальвеолярного отека выглядели спавшимися и дистелектазированными. Эти данные, на наш взгляд, свидетельствуют о том, что в указанный период эксперимента происходит бурное вымывание сурфактанта легких с внутриальвеолярной поверхности, из-за чего даже имеющийся в просвете альвеол сурфактант не может осуществлять свою альвеолостабилизирующую функцию.

Дальнейшее удаление измененного в условиях выраженного интраальвеолярного отека сурфактанта легких происходит за счет его вымывания через респираторные бронхиолы, что подтверждается присутствием большого количества сурфактант-ассоциированных белков в просвете последних. При этом важно отметить, что обнаруживаемый в норме в цитоплазме нереснитчатых бронхиолоэпителиальных клеток (клетки Клара) SP-A в указанные сроки эксперимента практически не определялся, что указывает на угнетение белок- синтезирующей функции этих клеток.

Наряду с прогрессирующими по мере увеличения срока эксперимента явлениями отека, дистрофическими и деструктивными изменениями компонентов АГБ, наблюдаются явления компенсаторного характера в виде гипертрофированных альвеолоцитов II типа с признаками высокой функциональной активности и большого количества в просвете альвеол активно функционирующих альвеолярных макрофагов.

Результаты, полученные в более поздние сроки эксперимента (12 часов - 1 сутки) показали, что в большинстве альвеолоцитов II типа отсутствовали указанные белки, что говорит о резком снижении белоксинтезирующей функции этих клеток. В редких случаях на внутриальвеолярной выстилке определялись гранулы SP-B. Внутри альвеол сурфактант-ассоциированные белки, как правило, обнаруживались в виде скоплений, свободно располагающихся в большом количестве отечной жидкости. В некоторых альвеолярных макрофагах, которые скапливались в просвете альвеол, следов сурфактант-ассоциированных белков обнаружить не удавалось.

Полученные данные в более поздние сроки эксперимента (1-3 сутки после ОАИ) убедительно свидетельствуют о почти полном прекращении синтеза сурфактанта на фоне грубых изменений компонентов АГБ, в первую очередь со стороны погибающих и десквамирующихся с базальной мембраны альвеолоцитов II типа. Большинство альвеол заполнены фибринозным экссудатом и либо перерастянуты, либо находились в состоянии дис- и ателектаза, клетки альвеолярного эпителия в большинстве своем разрушены и базальная мембрана выглядела обнаженной, а интерстиций - резко расширенным за счет скопившейся отечной жидкости. Появлялись гиалиновые мембраны в виде гомогенных эозинофильных лент, состоящих их фибрина и клеточных обломков. Встречались лишь отдельные участки с единичными сохраненными альвеолоцитами II типа, которые выглядели резко отечными, имели просветленную и резко разрыхленную цитоплазму, в которой, в свою очередь, отсутствовали гранулы сурфактант-ассоциированных белков. В просветах альвеол наблюдались обрывки мембранных структур, фрагменты десквамированных альвеолоцитов, эритроциты, фибрин, скопления альвеолярных макрофагов, среди которых к 3 суткам эксперимента преобладали неактивные, уже осуществившие свою функцию, формы. В альвеолярных макрофагах следов сурфактант- ассоциированных белков обнаружить не удавалось. Незначительные скопления SP-B при полном отсутствии SP-A и SP-C обнаруживались в отечной жидкости. Отмечалось присутствие отдельных гранул, преимущественно SP-B, в просвете респираторных бронхиол.

Эти данныесвидетельствуют о необратимых изменениях в сурфактантной системе легких, являющихся следствием как процессов прекращения синтеза и секреции поверхностно-активного вещества почти полностью погибшими альвеолоцитами II типа, так и почти полным вымыванием из альвеол отечной жидкостью остатков эндогенного сурфактанта, измененного под воздействием плазменных белков и/или выделяемого через АГБ этанола и его метаболитов.

Таким образом, полученные нами результаты иммуногистохимического исследования свидетельствуют о том, что в условиях ОАИ в системе сурфактанта легких происходят прогрессирующие по мере увеличения срока эксперимента изменения в распределении и локализации сурфактант-ассоциированных белков SP-A, SP-B, SP-C. При этом в первую очередь, нарушается синтез и секреция альвеолоцитами II типа SP-A и SP-C, тогда как их способность к выработке SP-B еще долгое время сохраняется.

Описанные изменения, по-видимому, являются следствием не только нарушения синтеза и секреции сурфактант-ассоциированных белков поврежденными альвеолоцитами II типа, но и результатом вымывания сурфактанта из просвета альвеол все возрастающей отечной жидкостью, инактивацией уже находящегося в просвете альвеол сурфактанта как белками плазмы крови, так и выделяемыми через структуры АГБ этанолом и его метаболитами.

Полученные данные иммуногистохимического исследования сурфактант- ассоциированных белков SP-A, SP-B и SP-C позволяют более четко определить степень обратимости структурных сдвигов в компонентах АГБ вследствие острой алкогольной интоксикации. На основании анализа результатов, можно сделать вывод, что в легочной ткани развиваются манифестные изменения структурных компонентов АГБ, которые могут быть разделены на две стадии.

В I стадии (в пределах 12 часов) преобразования в структуре АГБ и нарушения в распределении и локализации сурфактант-ассоциированных белков носят обратимый характер, поскольку сурфактант - синтезирующая и сурфактант-секретирующая функции альвеолоцитов II типа сохраняется.

Во II стадии (через 1-3 сутки после начала эксперимента) эти изменения приобретают необратимый характер за счет гибели ответственных за синтез и секрецию альвеолоцитов II типа и других компонентов АГБ, а также из-за почти полного отсутствия сурфактанта в альвеолоцитах.

В конечном итоге негативное действие алкоголя с позиций морфологического анализа в легких может реализовываться в виде проявлений, характерных для острого повреждения легких (ОПЛ), крайним выражением которого является развитие острого респираторного дистресс-синдрома. Причем, ОПЛ в условиях острой алкогольной интоксикации развивается вследствие как прямого токсического действия этанола на структуры АГБ, так и непрямого (опосредованного) воздействия на лёгкие. Острый респираторный дистресс- синдром, развившийся в финале алкогольного ОПЛ, часто является объектом судебно-медицинской диагностики, и в этих случаях судебно-медицинскому эксперту необходимо выяснить роль изменений лёгких в танатогенезе. Проведение дальнейших исследований в этом направлении необходимо для разработки критериев диагностики наркоманий, токсикоманий, алкогольной болезни и смешанных хронических интоксикаций, а также выявить признаки различных вариантов танатогенеза. 1. Бабанин А.А., Скребкова О.Ю., Беловицкий О.В. Морфологические и судебно-экспертные аспекты висцеральной патологии при алкогольной болезни // «Проблемы, достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения»: Тр. Крым. гос. мед. ун-та им. С.И. Георгиевского. - Т. 139. - Ч. ІІ. - Симферополь, 2003. - С. 6-8. 2.

Загорулько А.К., Скребкова О.Ю. Иммуногистохимическое исследование сурфактант-ассоциированных белков при остром отравлении этанолом в эксперименте // Таврический медико-биологический вестник. -2003. - Т. 6. - № 4. - С. 45-49. 3.

Использование лабораторных животных в токсикологическом эксперименте (Методические рекомендации под редакцией проф., академика РАМН П.И. Сидорова). - Архангельск - 2002. - 15 с. 4.

Капустин А.В., Зомбковская Л.С., Панфиленко О.А., Серебрякова В.Г. О вариантах признаков смерти от острого отравления алкоголем, обусловленных различными особенностями танатогенеза. // Судебно-медицинская экспертиза. - 2003. - № 6. - С. 25-28. 5.

Сапожников А.Г., Доросевич А.Е. // Рук. Гистологическая и микроскопическая техника // Смоленск, 2000. - 476 с. 6.

Bernard G. R., Artigas A., Brigham KL., et al: The American-European Consensus Conference on ARDS: Definitions, mechanisms, relevant outcomes, and clinical trial coordination. //Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 1994. - Vol. 149. - P. 818-824. 7.

Lewis J. Surfactant Alterations in ARDS and Pneumonia // Appl. cardiopulm. pathophysiol. Contents. - 2000. - Vol. 9. - № 3. - Р. 265 - 267. 8.

Lewis J.F., Brackenbury A. Role of exogenous surfactant in acute lung injury. Crit Care Med. 2003 Apr; 31 (4 Suppl): S. 324-8. (Medline) 9.

Spragg R.G. Acute respiratory distress syndrome. Surfactant replacement therapy // Clinic in Chest. Medicine - 2000. - Vol.21. - P.670 - 689. 10.

Zhu S., Ware L.B., Geiser T., et al. Increased levels of nitrate and surfactant protein A nitration in the pulmonary edema fluid of patients with acute lung injury // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 2001. - Vol. 163. - P. 166-172.