Сидоров В.Л. АЛГОРИТМ ИССЛЕДОВАНИЯ ВЕЩЕСТВЕННЫХ ДОКАЗАТЕЛЬСТВ ПРИ УСТАНОВЛЕНИИ НАЛИЧИЯ СПЕРМЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИХ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

Санкт-Петербург

При установлении наличия спермы в пятнах на вещественных доказательствах первостепенное значение имеют ориентировочные или предварительные методы. Данные методики помогают судебно-медицинскому эксперту ориентироваться при исследовании вещественных доказательств, то есть найти более подозрительные участки, где уже доказательными методами устанавливают присутствие спермы (Туманов А.К., 1961, 1975; Томилин В.В.

и др., 1989, Барсегянц Л.О., 1997; Чарный В.И., 1998).

В судебно-медицинской практике достаточно долгое время применялась реакция на кислую фосфатазу (Чарный В.И., 1965, 1966; Зарецкая Е.Ф., Ачеркан Н.Н., 1980; Стегнова Т.В. и соавт., 1990; Londquist F., 1946; Kind S.S., 1964; Divall G.B., 1985; Chiasson D.A. et al., 1994).

Зингерман М.Я. (1973), а также Steinman G. (1995) рекомендуют для установления наличия спермы исследовать изоферменты кислой фосфатазы. В настоящее время в судебно-медицинской практике применяются также тестирующие полоски «Фосфатест». Все вышеперечисленные методики направлены на выявление только общей кислой фосфатазы и носят сугубо субъективный характер.

Нами разработана и апробирована методика выявления общей кислой фосфатазы, а также отделения простатической кислой фосфатазы от общей в пятнах на вещественных доказательствах колориметрическим методом с помощью диагностического набора «ACID PHOSPHATASE Colorimetric Humazym test» для сыворотки крови (тест-наборы приобретены в фирме «ВЕКТОР-БЕСТ». Принцип метода заключается в том, что 1-Нафтил фосфат гидролизуется кислой фосфатазой (КФ) к фосфату и переходит в 1-Нафтол, который преобразуется с FRTR-СОЛЬЮ (Красная быстрая соль) и способен к окрашиванию. Увеличение абсорбционной способности при длине волны в 405 нанометров пропорционально активности общей кислой фосфатазы в образце. Простатическая кислая фосфатаза может быть блокирована тартратом и может быть определена косвенно (через непростатическую кислую фосфатазу) путем вычисления разности в активности общей кислой фосфатазы и активности фосфатазы, оставшейся после подавления простатической кислой фосфатазы ингибитором (тартратом).

Для исследования были использованы сухие образцы спермы, слюны, крови и влагалищных выделений, из которых готовили навески по 15 мг.

Исследуемый материал помещали в пробирки и заливали по 0,2 мл дистиллированной воды с рН 7,2-7,6 для экстрагирования в течение 20 часов при 4°С. Затем вытяжки из объектов, как неразведенные, так и в разведениях 1:10 - 1:100000 помещали по 20 мкл в дубликате в лунки 96 луночного полистирольного планшета, добавляли в одни по 200 мкл субстратной смеси (в разведении 1:1 буферным раствором), а в другие лунки по 200 мкл субстрата, разведенного раствором тартрата, и инкубировали в термошейкере «ST-3» в течение 5 минут при 200 об/мин и 37°С. Оптическую плотность растворов измеряли фотометрически при длине волны 405 нм двукратно на ридере «SUNRISE» фирмы «TECAN» с трехминутным интервалом. В качестве положительного контроля использовали образец спермы в разведении 1:10, отрицательными контролями служили неразведенные экстракты из аналогичных навесок стерильной марли. Расчеты проводили рассчитывали по трем измерениям. Результаты исследования представлены в табл. 1.

Таблица 1

Зависимость оптической плотности, измеренной посредством ридера «SUNRISE» в лунках планшета, от разведения экстрактов из сухой спермы, слюны, крови и

влагалищных выделений человека Исследуемые образцы Разведения Значения оптической плотности (M±m) Сперма Субстрат Тартрат 1:10 2,123±0,099 1,316±0,163 1:100 0,960±0,044 0,231±0,059 1:1000 0,414±0,019 0,042±0,013 1:10000 0,195±0,043 0,023±0,002 1:100000 0,041±0,003 0,014±0,001 Слюна Субстрат Тартрат Цельный экстракт 0,099±0,12 0,022±0,002 1:10 0,15±0,003 0,016±0,002 1:100 0,013±0,003 0,013±0,001 Влагалищный секрет Субстрат Тартрат Цельный экстракт 1:10 0,257±0,031 0,015±0,005 0,036±0,003 0,005±0,001 1:100 0,012±0,001 0,014±0,001 Кровь Субстрат Тартрат Цельный экстракт 1,235±0,015 1,035±0,008 1:10 0,091±0,005 0,098±0,002 1:100 0,017±0,002 0,025±0,001 Стерильная марля Цельный экстракт Субстрат 0,002±0,001

В результате проделанных исследований было установлено, что при проведении измерений (см.

табл. 1) положительный результат был получен при реакции с субстратом с экстрактами из пятен сухой человеческой спермы в разведениях от 1:10 до 1:10000 (оптическая плотность от 2,123 до 0,195). В разведении 1:100000 был получен отрицательный результат. Следовательно, разведение 1:10000 следует считать порогом чувствительности данной реакции. При реакции с тартратом, смешанным с субстратом, в разведениях 1:10 и 1:100 было отмечено достаточно выраженное, но далеко не полное ингибирование простатической кислой фосфатазы (оптическая плотность 1,316 и 0,231), а в разведениях 1:1000 и 1:10000 наблюдалось практически полное ее ингибирование (оптическая плотность 0,042 и 0,023), что указывает на простатичесое происхождение кислой фосфатазы. При реакции с субстратом с экстрактами из пятен сухой человеческой крови, цельным и в разведении от 1:10, было отмечено выявление кислой фосфатазы (оптическая плотность от 1,235 до 0,091), при этом в реакции с тартратом, смешанным с субстратом, в данных экстрактах был отмечен фактически такой же уровень кислой фосфатазы, без его снижения (оптическая плотность 1,035 и 0,098), что свидетельствует о том, что данная фосфатаза имеет не простатическое происхождение. В разведении 1:100 кислая фосфатаза не выявлялась. С цельными экстрактами из пятен сухого человеческого влагалищного секрета отмечалось выявление кислой фосфатазы (оптическая плотность от 0,257), при этом при реакции с тартратом, смешанным с субстратом, в цельном экстракте наблюдалось практически полное ее ингибирование (оптическая плотность 0,036), что указывает на простатическое происхождение фосфатазы. В разведении 1:100 кислая фосфатаза не выявлялась.

С цельным экстрактом из сухой человеческой слюны при реакции с субстратом наблюдалось незначительное выявление кислой фосфатазы (оптическая плотность 0,099), которая достаточно сильно ингибировалась при реакции с тартратом, смешанным с субстратом (оптическая плотность 0,022). В разведениях 1:10 и 1:100 выявления кислой фосфатазы не наблюдалось.

С цельным экстрактом из стерильной марли при реакции с субстратом отмечалось очень низкое значение оптической плотности (0,002).

Из результатов проведенных исследований следует, что наиболее целесообразным является использование для экспертных целей водных экстрактов из тампонов с содержимым влагалища, либо из пятен на вещественных доказательствах в разведении 1:10, так как кислая фосфатаза хорошо выявляется в водных растворах пятен сухой спермы человека в разведениях 1:1000 и 1:10000, в экстрактах из сухих влагалищных выделений, сухой крови и сухой слюны человека при разведении 1:10 кислая фосфатаза практически не выявляется. Мы считаем, что экстракты из сухой слюны человека и экстракты из сухих влагалищных выделений человека, в разведении 1:10 целесообразно использовать в качестве отрицательных контролей. Это подтвердилось на практике, так как при низком значении оптической плотности в отрицательных контролях мы получаем большое количество ложноположительных результатов. При высокой концентрации спермы в исследуемом материале (разведения экстрактов из сухой спермы человека 1:10 и 1:100) наблюдается не полное, а лишь частичное ингибирование простатической фосфатазы тартратом. Следовательно, слишком концентрированные вытяжки из пятен на вещественных доказательствах, либо из тампонов с содержимым влагалища, следует разводить в 5 или в 10 раз, а затем исследовать повторно как с ингибитором, так и без него, чтобы утверждать, что фосфатаза в исследуемых пятнах простатическая. При проведении практических экспертных исследований мы видим, что ингибирование хорошо наблюдается при значении оптической плотности в исследуемой вытяжке 0,4-0,5, а, значит, надо стараться подобрать такое разведение, которое привело бы значение оптической плотности к вышеуказанному значению. При проведении экспертизы вещественных доказательств в качестве положительного контроля целесообразно, по нашему мнению, использовать экстракты из сухой спермы человека в разведении 1:10 и 1:100.

Таким образом, метод выявления общей кислой фосфатазы, а также отделения простатической кислой фосфатазы от общей в пятнах на вещественных доказательствах колориметрическим методом с помощью диагностического набора «ACID PHOSPHATASE Colorimetric Humazym test» для сыворотки крови, который применяется в клинической практике для диагностических целей, используемый нами для ориентировочного установления наличия спермы в тампонах и в пятнах на вещественных доказательствах, является специфичным и высокочувствительным методом с объективной регистрацией и компьютерной обработкой результатов.

Данная методика отличается высокой производительностью и экономичностью (цена одного исследование в несколько раз меньше, чем при применении диагностических тест-полосок «Фосфатест»), а также, в отличие от других ранее применяемых методик, позволяет отделить общую кислую фосфатазу от простатической.

Вышеизложенное позволяет рекомендовать данный метод для внедрения и широкого использования в экспертной практике.

Мы пришли к выводу, что целесообразен следующий порядок исследования вещественных доказательств при установлении наличия на них спермы: 1.

Вырезки и смывы с вещественных доказательств помещают в пробирки и заливают с небольшим избытком дистиллированной водой с рН 7,2-7,6 и экстрагируют в течение 20 часов при 4°С. 2.

Устанавливают наличие общей кислой фосфатазы колориметрическим методом с помощью диагностического набора «ACID PHOSPHATASE Colorimetric Humazym test», а также с помощью термошейкера «ST-3» и ридера «SUNRISE» фирмы «TECAN». 3.

Отделяют простатическую кислую фосфатазу от непростатической с помощью вышеуказанного тест-набора и вышеперечисленного оборудования. 4.

Вытяжку отсасывают и переносят в другие пробирки, при длительном хранении помещают в условия бытового холодильника. 5.

Кусочки исследуемого материала заливают 10% раствором аммиака, а затем исследуют методом концентрированного извлечения сперматозоидов (по Серопяну А.К.). 6.

В случае отрицательного результата исследуют сохраненную ранее вытяжку на наличие простатического антигена человека (ПСА) с помощью диагностического набора «ПСА общий-ИФА-БЕСТ Т-8458», а также с помощью термошейкера «ST-3», автоматического вошера «COLUMBUS pro» и ридера «SUNRISE» фирмы «TECAN».

При таком порядке исследования можно добиться наибольшей рациональности и эффективности при получении результатов, а также значительно сэкономить трудозатраты. В случае азооспермии и олигозооспермии проходящих по делу лиц, установление наличия ПСА в следах на вещественных доказательствах позволяет доказательно установить в них наличие спермы.

Несколько таких случаев уже встречались в нашей экспертной практике.

Список литературы: I.

Барсегянц Л.О. Суд.-мед. экспертиза вещественных доказательств // В кн.: Судебная медицина. Под редакцией проф. Томилина В.В. - М., 1997. - С. 241-278.

2 Зарецкая Е.Ф., Ачеркан Н.Н. Установление наличия спермы в пятнах реакцией ингибиции кислой фосфатазы тартратом // Судебно-медицинская экспертиза. - 1980. - Т. 23. - № 4. - С. 33-35. 3.

Зингерман М.Я. Исследование изоферментов кислой фосфотазы в пятнах спермы // В кн.: Седьмая республиканская (расширенная) конференция научно- практическая конференция СМ экспертов. - Карельская АССР, Петрозаводск, 1973. - С. 112-114. 4.

Стегнова Т.В., Иоанесян Л.С., Лозинский Т.Ф. Установление наличия и групповой принадлежности спермы в смешанных пятнах методом изоэлектрического фокусирования // Суд.-мед. экспертиза. - 1990. - Т. 33. - № 2. - С. 33-36. 5.

Томилин В.В., Барсегянц Л.О., Гладких А.С. Судебно-медицинское исследование вещественных доказательств. - М.: Медицина. - 1989. - 303 с. 6.

Туманов А.К. СМ исследование вещественных доказательств. - М., 1961. -576 с. 7.

Туманов А.К. Основы судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств. - М.: Медицина. - 1975. - 407 с. 8.

Чарный В.И. Об ориентировочном значении количественной реакции на кислую фосфатазу при установлении наличия спермы в пятнах // Судебно-медицинская экспертиза. - 1965. - Т. 8. - № 2. - С. 18-22. 9.

Чарный В.И. О применении количественной реакции на кислую фосфатазу при исследовании семенных пятен // В кн.: Актуальные вопросы судебной медицины и криминалистики. - Л., 1966. - С. 141-142. 10.

Чарный В.И. СМ экспертиза биологическими методами // В кн: Судебная медицина. Под редакцией проф. Матышева А.А. - СПб., 1998. - С. 435-468. II.

Chiasson D.A.; Vigorito R., Lee Y.S., Smialek J.E., Interpretation of postmortem vaginal acid phosphatase determinations // Am. J. Forensic Med. Pathol. - 1994. - Vol. 15. - № 3. - P. 242-246. 12.

Divall G.B. The application of electrophoretic techniques in field of criminology // Electrophoresis. - 1985. - Vol. 6. - P. 249-250. 13.

Kind S.S. in: Curry A.S. (Ed) Methods in Forensic Science // Interscience. - 1964. - Vol. 3. - P. 266-288. 14.

Londquist F. Function of prostatic phosphotase // Nature. - 1946. - Vol. 158. - P. 710-711.

<< | >>

↑

Источник: В.А. Клевно, В.Д. Исакова. АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЙ ЭКСПЕРТИЗЫ ТРУПА /. 2008

Еще по теме Сидоров В.Л. АЛГОРИТМ ИССЛЕДОВАНИЯ ВЕЩЕСТВЕННЫХ ДОКАЗАТЕЛЬСТВ ПРИ УСТАНОВЛЕНИИ НАЛИЧИЯ СПЕРМЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИХ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ:

- Криминалистическая методика - Криминалистическая тактика - Криминалистическая техника - Обеспечение следствия - Основы криминалистики - Проблемы криминалистики - Работа с микрообъектами - Судебная медицина - Судебная экспертиза -