Хроматомасс-спектрометрия.

Режим хроматографирования.

Условия детектирования. Энергия электронов ионизации 70эВ. Регистрация масс-спектров в режиме полного сканирования в интервале масс 30550 а.е.м.

Управление прибором и сбор данных проводился с помощью программного обеспечения MSD Chemstation vers. D.03.00.611. Обработка результатов и анализ данных - в Data Analysis и AMDIS. После хроматографирования пробы идентификация веществ проводилась по временам удерживания и совпадению масс-спектра вещества с библиотечным. Поиск осуществлялся по библиотечным стандартным масс-спектрам веществ: PMW_TOX.3, WILEY7n, NISTO5.

На хроматограмме по времени удерживания (22,55 мин) и масс-спектру (характеристические ионы m/z 135, 298, 108, 190, 56, 77, 163 а.е.м.) идентифицировано лекарственное средство перебедил, применяемое для лечения болезни Паркинсона.

Изолирование токсических веществ из биотканей (желудок, почка) проводилось подкисленным спиртом. После осаждения белков осуществлялась жидкость-жидкостная экстракция хлороформом при рН 2-3 и при рН 10 (после добавления 25% раствора гидрокисда аммония).

Для выделения токсических веществ из крови (2 мл) применялась прямая жидкость-жидкостная экстракция хлороформом при рН 2-3 и при рН 10 (после добавления 25% раствора гидроксида аммония).

По испарении хлороформно-кислых извлечений из внутренних органов наблюдались остатки желтоватого цвета.

По 1 мл извлечений исследовали на пластинке «Сорбфил ПТС-А-УФ» в системе растворителей - бензол:диоксан: 25% раствор гидроксида аммония (60:35:5). Проявители - последовательно УФ-свет, реактив Драгендорфа. При наблюдении пластинки в УФ свете в зоне нанесения извлечений наблюдались пятна с интенсивной зеленой флуоресценцией с Rf = 0,44, соответствующие по окраске и значению Rf дипиридамолу. При последующей обработке пластинки реактивом Драгендорфа в зоне нанесения извлечений наблюдались пятна оранжевого цвета с Rf = 0,88 и 0,44, а в зоне свидетелей - пирибедила и дипиридамола наблюдались оранжевые пятна с Rf = 0,88 и 0,44, соответственно.

При исследовании в тонком слое сорбента извлечения из крови флуоресцирующих пятен не отмечено, а при обработке пластинки реактивом Драгендорфа наблюдалось оранжевое пятно с Rf = 0,88.

При спектрофотометрическом исследовании в спектре поглощения извлечения из желудка в 96% этиловом спирте отмечены максимумы поглощения при 279,8+289,7+309,8 нм, а из почки - при 275,3 нм. В этих условиях в спектральной кривой раствора пирибедила наблюдались максимумы поглощения при 244,6 нм и 287,7 нм, а раствора дипиридамола - при 284,8 нм и 308,4 нм.

Результаты тонкослойной хроматографии и ультрафиолетовой спектрофотометрии позволяют предположить наличие в извлечениях из внутренних органов двух веществ - пирибедила и дипиридамола.

Этот предположение было подтверждено результатами исследования извлечений желудка, почки и крови из щелочной среды методами ультрафиолетовой спектрофотометрии, тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии, а также хроматомасс-спектрометрии.

Спектрофотометрия в ультрафиолетовой области.

Остатки по испарении по 0,5 мл извлечений растворяли в 5 мл 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты и снимали УФ спектры полученных растворов на спектрофотометре «СФ-2000-01» в пределах 220-360 нм в кварцевой кювете толщиной слоя 1 см.

Одновременно снимались спектры поглощения пирибелила,

дипиридамола и карбамазепина в 0,1 М растворе хлористоводородной кислоты. При этом в их спектрах наблюдалось по 2 максимума поглощения: у пирибедила - при 235,9+287,1 нм, дипиридамола - при 238,0+282,7 нм, у карбамазепина - при 236,5+285,6 нм.

Тонкослойная хроматография. По 1 мл извлечений исследовали на 3 пластинки «Сорбфил ПТСХ-А-УФ» в системах растворителей: система 1 - метанол: 25% раствор гидроксида аммония (100:1,5), система 2 - этилацетат: метанол: 25% раствор гидроксида аммония (17:2:1) и система 3 - бензол: диоксан: 25% раствор гидроксида аммония (60:35:5). Проявители - последовательно УФ-свет, 3% раствор хлорида железа (III) и, наконец, реактив Драгендорфа. Пластинка 1. Система 1. При наблюдении пластинки в УФ свете в зоне нанесения извлечений, кроме крови, наблюдались пятна с интенсивной зеленой флуоресценцией с Rf = 0,84, соответствующие по окраске и значению Rf = 0,84 свидетелю-дипиридамолу. При обработке пластинки раствором железа в извлечениях отмечены пятна розовато- фиолетового цвета с Rf = 0,76, соответствующие метаболиту анальгина -4- монометиламиноантипирину. При последующей обработке пластинки реактивом Драгендорфа в зоне нанесения извлечений наблюдались пятна оранжевого цвета с Rf =0 ,84, 0,76 и 0,71, соответствующие свидетелям - дипиридамолу (Rf = 0,84), 4-монометиламиноантипирину (0,76) и пирибедилу (0,71). Пластинка 2. Система 2. При наблюдении пластинки в УФ свете в зоне нанесения извлечений, кроме крови, наблюдались пятна с интенсивной зеленой флуоресценцией с Rf=0,64, соответствующие по окраске и значению (Rf=0,64) свидетелю-дипиридамолу. При обработке пластинки раствором железа в извлечениях отмечены пятна розовато-фиолетового цвета с Rf=0,60, соответствующие метаболиту анальгина - 4-монометиламиноантипирину.

Пластинка 3. Система 3. При наблюдении пластинки в УФ свете в зоне нанесения извлечений, кроме крови, наблюдались пятна с интенсивной зеленой флуоресценцией с Rf = 0,44, соответствующие по окраске и значению (Rf = 0,44) свидетелю-дипиридамолу. При обработке пластинки раствором железа в извлечениях отмечены пятна розовато-фиолетового цвета с Rf = 0,33, соответствующие метаболиту анальгина - 4-монометиламиноантипирину. При последующей обработке пластинки реактивом Драгендорфа в зоне нанесения извлечений из желудка и почки наблюдались пятна оранжевого цвета с Rf = 0,88, 0,44 и 0,33, соответствующие свидетелям - пирибедилу (0,88), дипиридамолу (Rf = 0,44) и 4-монометиламиноантипирину (0,33). В извлечении из крови отмечены оранжевые пятна, соответствующие свидетелям - пирибедилу (0,88) и 4- монометиламиноантипирину (0,33).

При высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматограммах извлечений из внутренних органов наблюдалось два пика со временем удерживания 11,61 мин, соответствующий пирибедилу (1=242+286 нм) и со временем удерживания 14,5 мин, соответствующий дипиридамолу (1=228+288 нм).

При хроматомасс-спектрометрическом (ГХ-МС) исследовании в крови, желудке и почке идентифицированы пирибедил и 4-монометиламиноантипирин. Установлено, что в указанных выше условиях ГХ-МС свидетель - дипиридамол не определяется.

Представленный случай из практики, интересен не только разработкой методики судебно-химического исследования лекарственного средства - пирибедила, но и наглядным доказательством возможностей лаборатории, оснащенной современным аналитическим оборудованием, обеспечивающим получение достоверных результатов в случаях комбинированных отравлений.